多巴胺是一種重要的神經(jīng)傳導物質(zhì)，用來幫助細胞傳送脈沖，它與帕金森氏癥、藥物成癮、精神分裂癥、多動癥和創(chuàng)傷后壓力綜合征等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關。

為更好地研究多巴胺在生理和病理過程中的作用，研究人員需要擁有一種能夠?qū)崟r、靈敏、特異地監(jiān)測多巴胺的趁手“兵器”。此前，北京大學生命科學學院李毓龍實驗室開發(fā)了一系列監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)的熒光探針，其中包括第一代多巴胺探針。

10月22日，李毓龍實驗室與美國紐約大學和美國國立衛(wèi)生研究院合作，在《自然·方法學》雜志在線發(fā)表論文，報告了新型紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開發(fā)應用成果。

綠色熒光探針讓細胞自己發(fā)光

多巴胺是大腦中含量最豐富的兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，這種腦內(nèi)分泌物與運動控制、動機、學習、記憶、情緒等生理過程有關，負責傳遞興奮及開心的信息，具有調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種生理功能。

20世紀50年代，瑞典科學家阿爾維德·卡爾森確定了多巴胺是腦內(nèi)信息傳遞者的角色，讓人們認識到一旦人類多巴胺調(diào)節(jié)系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，往往會出現(xiàn)帕金森氏癥、精神分裂癥、抽動穢語綜合征、注意力缺陷多動綜合征以及垂體腫瘤的發(fā)生等。卡爾森據(jù)此研制出治療這類疾病的藥物，并獲得了2000年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

“科學家如果擁有一種能以高時空分辨率、高特異性和高靈敏度感知多巴胺濃度變化的工具，將有助于研究多巴胺在生理和病理條件下的多種功能，去追蹤在活體模式生物中、復雜行為模式下多巴胺信號的動態(tài)變化情況。”李毓龍說。

傳統(tǒng)的監(jiān)測方法，主要是通過微透析對腦脊液進行采樣并生化監(jiān)測、通過碳纖電極進行記錄等。這些監(jiān)測手段各自存在一些局限性，如缺乏足夠的時間和空間分辨率，難以精確反映神經(jīng)遞質(zhì)的真實動態(tài)信息;監(jiān)測特定神經(jīng)遞質(zhì)的特異性不夠高;監(jiān)測方法對生物的損傷性大等。因此，科學家一直致力于優(yōu)化已有方法，或者開發(fā)新方法，力圖彌補短板，取得突破。

自2018年起，李毓龍實驗室就開發(fā)出可基因編碼的熒光探針系列，即GRAB探針系列，其中包括多巴胺探針。李毓龍表示，最重要的一點是，他們的新方法“能讓細胞自己發(fā)光”。

此前，許多生物學家已經(jīng)解決了如何把熒光蛋白“放”到細胞里的難題。只要在細胞中轉入編碼基因的特定信息序列，細胞自己就會通過“中心法則”，把這個信息序列“翻譯”成特定的蛋白質(zhì)。這個能被可見光激發(fā)產(chǎn)生紅色或綠色熒光的蛋白質(zhì)會自動“走”到細胞膜上，還會對多巴胺敏感，也就是結合神經(jīng)遞質(zhì)后發(fā)出熒光信號，從而報告信號位置。

“然后你就可以拍照，或拍個視頻，哪個地方亮，哪個地方就有多巴胺釋放。”李毓龍向科技日報記者介紹，這樣就可以通過熒光成像的方法，將原本不可見的神經(jīng)遞質(zhì)的動態(tài)變化，轉變成直觀、易測的熒光信號，進行實時監(jiān)測，創(chuàng)造性地克服了已有多巴胺監(jiān)測手段中時空分辨率低、分子特異性差等諸多問題，而且對細胞幾乎不會造成損傷。

他們通過轉染、病毒注射等手段，將探針表達在細胞、小鼠腦片或活體的果蠅、斑馬魚、小鼠上，監(jiān)測到了電刺激小鼠腦片引發(fā)的多巴胺釋放，并在活體果蠅、斑馬魚和小鼠的大腦中監(jiān)測到了與嗅覺刺激、視覺刺激、學習記憶、交配行為相關的多巴胺信號變化。

升級版探針可以多色“合作”

近兩年來，李毓龍團隊對研發(fā)的第一代探針進行了改造和優(yōu)化。“就像電腦的芯片，從第一代到第二代，它的運算速度越來越快，多巴胺探針，更新?lián)Q代后變得更靈敏，而且所帶來的非損傷性或者說副作用要更少。”李毓龍說。

第一代多巴胺探針的局限在于，只有在多巴胺釋放較多的時候才能夠監(jiān)測到，監(jiān)測也需要較長的時間。但如果有了更靈敏的探針，就可以實時地在一些精細的動物行為學上——比如說受獎賞或受懲罰時，抑或是在成癮或疾病發(fā)作時，更精準地監(jiān)測多巴胺的動態(tài)變化。針對新一代多巴胺探針，李毓龍等人在細胞、腦片、果蠅、小鼠中對其表現(xiàn)進行了系統(tǒng)地研究，并通過一系列對照實驗，對探針信號的特異性進行了驗證。

新一代探針還提供了多樣化監(jiān)測的可能。“探針是由熒光蛋白和神經(jīng)遞質(zhì)受體二者組合而成的。我們在第一代探針的基礎上，對這兩部分蛋白交互界面的重要氨基酸依次嘗試了不同的種類變化，并逐個監(jiān)測探針的特性;隨后對表現(xiàn)優(yōu)秀的氨基酸變化形式進行排列組合，以實現(xiàn)‘強強聯(lián)合’，達到最優(yōu)化的探針監(jiān)測效果。”李毓龍說。此外，他們嘗試更換不同種類的熒光蛋白，開發(fā)出不同熒光顏色的探針。

“在我們的大腦中，有很多很復雜的化學信號，多巴胺只是其中一種。”李毓龍解釋說，除了令人愉悅的多巴胺，還有被認為管理著壓力感的腎上腺素，或者是調(diào)節(jié)抑郁情緒的5-羥色胺。

因此，當有一個對“幸福感”敏感的多巴胺紅色探針，以及對抑郁情緒或壓力感敏感的綠色神經(jīng)遞質(zhì)探針在一起工作時，人們就可以同時看到不同神經(jīng)遞質(zhì)之間的關系，從而更好地理解大腦的化學物質(zhì)如何進行協(xié)同變化。

他們開發(fā)的新型紅色熒光多巴胺探針，可與其他鈣離子探針、神經(jīng)遞質(zhì)探針等綠色熒光探針共同使用，實現(xiàn)多種信號的同時記錄。另外他們還優(yōu)化出具有更高靈敏度及成像信噪比的第二代綠色熒光多巴胺探針。

體外實時探測多巴胺不是夢

人們監(jiān)測大腦內(nèi)化學物質(zhì)之前多使用的是化學方法，比如通過試劑監(jiān)測受體的化學反應;或者通過質(zhì)譜法，來監(jiān)測特定大小的分子。“化學試劑本身是有毒的;質(zhì)譜法要首先讓這些分子離子化，活細胞根本無法承受。”李毓龍表示，所以這些監(jiān)測方法不適合在活體動物中使用。

李毓龍團隊運用新一代多巴胺探針，在活體動物自由活動時也能記錄其深部腦區(qū)中多巴胺的動態(tài)變化。相比于第一代探針，經(jīng)過優(yōu)化得到的第二代綠色熒光探針，熒光更亮，結合神經(jīng)遞質(zhì)后信號變化更顯著。此外，新型紅色熒光探針在對多巴胺監(jiān)測時，從先前的單一綠色熒光拓展到多色熒光。因此，兩款新型探針可以更容易與神經(jīng)科學領域其他重要技術，如鈣成像、光遺傳學等結合使用。新型探針也為多巴胺受體的相關藥物篩選優(yōu)化提供了新的可能。

李毓龍向記者介紹，目前他們已著手研發(fā)更新一代的熒光探針，讓紅光更紅。“因為在活體中，探針就像信號燈或者是導航燈，更紅的光穿透力更強，信噪比更高，也更容易監(jiān)測到。”現(xiàn)在監(jiān)測這些熒光信號，人們還得給動物體內(nèi)加一根光纖，才能夠監(jiān)測到多巴胺信息。

想要觀測動物大腦里是“怎么想”的，更真實、準確地理解其神經(jīng)系統(tǒng)怎么工作，需要熒光探針有足夠的亮度，甚至在自由活動的動物體外也可直接看到紅色的、穿透力足夠強的光。“這些理論上是可以實現(xiàn)的。”李毓龍說，而這正是他們努力的方向。(趙漢斌)